СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ ............................................. 7
ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................... 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................ 12
1.1. Организация кальциевого сигналинга в живой клетке ................................ 12
1.2. Кальциевый сигналинг у растений .................................................................. 13
1.2.1. Кальциевые каналы .................................................................................... 14
1.2.1.1. Лиганд-зависимые кальциевые каналы ............................................. 14
1.2.1.2. Механосенсорные каналы .................................................................. 22
1.2.2. Кальций-связывающие белки .................................................................... 26
1.2.2.1. Кальценеврин-B-подобные белки ...................................................... 26
1.2.2.2. Кальмодулин и кальмодулин-подобные белки ................................ 28
1.2.2.3. Протеинкиназы .................................................................................... 30
1.2.2.4. Белки с C2-доменом ............................................................................ 31
1.2.3. Удаление кальция из цитозоля .................................................................. 33
1.2.3.1. Ca2+-АТФазы ........................................................................................ 33
1.2.3.2. Na+/ Ca2+-антипортеры ........................................................................ 35
1.2.4. Предшествующие и дальнейшие пути передачи сигнала ...................... 37
1.2.4.1. Кальмодулин-связывающие белки: ферменты и каналы ................ 37
1.2.4.2. Кальмодулин-связывающие белки: факторы транскрипции .......... 42
1.2.5. Физиологические аспекты кальция у растений ....................................... 45
1.2.5.1. Кальциевые осцилляции ..................................................................... 46
1.2.5.3. Кальций и межклеточное взаимодействие ....................................... 49
1.2.5.4. Ответ растений на холодовой стресс ................................................. 51
3
1.3. Кальциевая регуляция у бактерий ................................................................... 55
1.3.1. Регуляция внутриклеточной концентрации Ca2+ у бактерий ................. 55
1.3.1.1. Кальциевые каналы ............................................................................. 55
1.3.1.2. Ca2+-АТФазы ........................................................................................ 58
1.3.1.3. Ca2+-антипортеры ................................................................................ 59
1.3.2. Кальций-связывающие белки .................................................................... 60
1.3.2.1. Белки с ЕF-рукой и доменами, подобными ЕF-руке ....................... 60
1.3.2.2. Белки с последовательностью β-рулона (домен RTX) .................... 62
1.3.2.3. Белки с мотивом «греческого ключа» ............................................... 63
1.3.3. Физиологическая роль кальция у бактерий ............................................. 64
1.3.3.1. Роль кальция в процессах хемотаксиса бактерий ............................ 64
1.3.3.2. Роль кальция в образовании спор ...................................................... 65
1.3.4 Заключение ................................................................................................... 65
1.4. Кальциевая регуляция у цианобактерий ......................................................... 67
1.4.1. Предполагаемые элементы системы кальциевой регуляции у
цианобактерий ....................................................................................................... 67
1.4.2. Возможная физиологическая роль кальция у цианобактерий ............... 70
2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ...................................................... 73
2.1. Synechocystis sp. PCC 6803, объект исследования ......................................... 73
2.1.1. Условия культивирования Synechocystis ................................................. 76
2.1.2. Трансформация Synechocystis ................................................................... 77
2.1.3. Выделение ДНК из Synechocystis ............................................................. 78
2.1.4. Определение содержания нуклеиновых кислот в пробе ........................ 79
2.1.5 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле ............................. 79
4
2.2. Этапы клонирования ДНК ............................................................................... 80
2.2.1. Работа с базами данных ............................................................................. 80
2.2.2. Полимеразная цепная реакция .................................................................. 80
2.2.3. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля .................................... 81
2.2.4. Лигирование и рестрикция ........................................................................ 81
2.2.5. Клонирование ПЦР-продукта .................................................................... 82
2.2.6. Трансформация E. coli ................................................................................ 82
2.2.7. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli ........................................ 83
2.3. Анализ экспрессии генов Synechocystis .......................................................... 84
2.3.1. Фиксация проб и выделение РНК из Synechocystis ................................ 84
2.3.2. Обратная транскрипция ............................................................................. 84
2.3.3. ПЦР в реальном времени и анализ данных .............................................. 85
2.4. Определение содержания кальция в пробах .................................................. 87
2.5. Экспериментальная часть ................................................................................. 88
2.5.1. Выбор генов для мутагенеза ...................................................................... 88
2.5.2. Выбор генов для исследования транскрипции ........................................ 90
2.5.3. Оценка внутриклеточного содержания кальция ..................................... 94
2.5.4. Влияние различных концентраций внеклеточного кальция на
транскрипцию генов, индуцируемых холодом .................................................. 95
2.5.5. Ингибиторный анализ ................................................................................ 95
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ .................................................................... 98
3.1. Измерение относительного содержания кальция в клетках ......................... 98
3.2. Влияние внеклеточной концентрации кальция на транкрипцию генов
ответа на холодовой стресс ................................................................................... 101
5
3.3. Ингибиторный анализ транскрипции генов ответа на холодовой стресс с
верапамилом ........................................................................................................... 104
3.3.1. Гены, регулируемым двухкомпонентной системой регуляции ........... 104
3.3.1.1. Оценка транскрипции генов в мутантных клетках ........................ 105
3.3.1.2. Оценка светозависимости транскрипции генов ответа на
холодовой стресс у мутантных организмов ................................................. 109
3.3.1.3. Влияние верапамила на транскрипцию генов ответа на холодовой
стресс ............................................................................................................... 109
3.3.2. Холодоиндуцируемые гены с неизвестной системой регуляции ........ 113
3.3.2.1. Транскрипция Hik33-независимых генов в мутантных клетках .. 114
3.3.2.2. Светозависимость экспрессии генов в мутантных клетках .......... 118
3.3.2.3. Оценка влияния верапамила транскрипцию генов ответа на
холодовой стресс ............................................................................................ 120
3.3.3. Заключение ................................................................................................ 124
3.4. Влияние «откачивания» кальция из клеток на низкотемпературную
индукцию генов ...................................................................................................... 126
3.4.1. Гены, регулируемые двухкомпонентной системой регуляции Hik33
Rre26 ..................................................................................................................... 127
3.4.2. Гены с неизвестной системой регуляции ............................................... 130
3.4.3. Проверка Hik33 как светозависимого сенсора ...................................... 135
3.4.4. Исследование мутанта по механосенсорному каналу MscL ................ 140
3.4.5. Заключение ................................................................................................ 146
3.5. Гипотетическая схема Са2+-зависимого пути регуляции генов ответа на
холодовой стресс .................................................................................................... 148
3.5.1. Светонезависимый путь ........................................................................... 148
6
3.5.2. Светозависимый путь ............................................................................... 150
3.6. Заключение ................................................................................................... 153
4.ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 154
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................... 155
