КИРИШ 6
I БОБ. PICHIA PASTORIS ЭКСПРЕССИЯ ТИЗИМИ, УНДА
РЕКОМБИНАНТ ОҚСИЛЛАРНИНГ ЭКСПРЕССИЯСИ ВА
АФЗАЛЛИКЛАРИ
12
1.1. HBsAg ва унинг Pichia рastoris тизимида олиниши 12
1.2. Экспрессия тизимлар ва Pichia pastoris 14
1.3. Pichia pastoris экспрессия тизимининг афзалликлари 22
1.4. Pichia pastoris ҳужайра штаммлари ва векторлар 27
1.5. Pichia pastoris фенотиплари, селектив маркерлар ва метанол
утилизация йўли
29
II БОБ. РЕКОМБИНАНТ S ОҚСИЛИНИ PICHIA PASTORIS
ЭКСПРЕССИЯ ТИЗИМИДА ОЛИШ УСУЛЛАРИ ВА
МАТEРИАЛЛАРИ
34
2.1 Материаллар 34
2.2. Тадқиқот усуллари 36
2.2.1. Колонияларни Петри ликопчасида штрихлаб экиш 36
2.2.2. Бактерия ва ачитқи ҳужайраларини суюқ мухитда ўстириш 36
2.2.3. Ҳужайраларни узоқ муддатли сақлаш 37
2.2.4. E. сoli дан плазмида ДНК сини ишқорий лизис усулида
ажратиш
37
2.2.5. Кўп миқдорда плазмида ДНК сини ишқорий лизис усулида
ажратиб олиш
38
2.3.6. Агарозали гель электрофорез 38
2.2.7. Рестрикция жараёни 38
2.2.8. Лигирлаш реакцияси 39
2.2.9. E. coli Neb5α электрокомпитент ҳужайраларини тайёрлаш 39
2.2.10. Клонлаштирилган плазмидаларни E. coli Neb5α
ҳужайраларига электропорация қилиш
403
2.2.11. Полимераза занжир реакцияси (PCR) 41
2.2.12. Pichia pastoris электрокомпитент ҳужайраларини тайёрлаш 41
2.2.13. Рекомбинант плазмидаларнинг Pichia pastoris
ҳужайраларига трансформацияси
42
2.2.14. S ген тутувчи рекомбинант Pichia pastoris ҳужайрасидан
геном ДНК сини ажратиш
43
2.2.15. pPIC3,5-S ва pPIC9-S рекомбинант плазмидалари
таркибидаги “S ген” ДНК фрагментининг нуклеин кислоталар
кетма-кетлигини аниқлаш
43
2.2.16. Pichia pastoris да S ген экспрессияси 44
2.2.17. Pichia pastoris дан рекомбинант S оқсилини ажратиш 45
2.2.18. Синтезланган рекомбинант оқсилнинг ИФА таҳлили 45
2.2.19. Трансблоттер қурилмасида оқсилларни нитроцеллюлоза
мембранасига кўчириш
47
III БОБ. ОЛИНГАН НАТИЖАЛАР ВА УЛАРНИНГ
МУҲОКАМАСИ
49
3.1 Гепатит В вируси юза антигенига жавоб берувчи S генини
pPIC3.5 ва pPIC9 плазмидаларига клонлаштириш
49
3.1.1. Праймерлар синтези ва гепатит В вирусидан S генни
амплификация қилиш
49
3.1.2. pPIC3.5 ва pPIC9 Pichia pastoris ачитқи замбруғи
векторларини клонлаштириш жараёнига тайёрлаш
52
3.1.3. S генини pPIC3.5 ва pPIC9 трансфер векторларига киритиш
ва олинган рекомбинант плазмидаларни Escherichia coli NEB-5
ҳужайрасига киритиш
56
3.1.4. Рекомбинант E. coli клонларини селекция қилиш 57
3.1.5. Рекомбинант pPIC3.5-S ва pPIC9-S плазмидаларнинг
электрофорез таҳлили
59
3.1.6. pPIC3.5-S ва pPIC9-S рекомбинант плазмидаларнинг ПЗР 604
таҳлили
3.1.7. S геннинг трансфер векторларга тўғри йўналишда
клонланганини аниқлаш
62
3.1.8. pPIC3.5-S ва pPIC9-S рекомбинант плазмидалари
таркибидаги S геннинг нуклеин кислоталар кетма-кетлигини
аниқлаш
64
3.2. pPIC3.5-S ва pPIC9-S рекомбинант плазмидаларини Pichia
pastoris ҳужайрасига киритиш
67
3.2.1. Трансформация унумининг ДНК концентрациясига
боғлиқлиги
68
3.2.3. Трансформация унумининг ҳужайра оптик зичлигига
боғлиқлиги
70
3.3. Рекомбинант Pichia pastoris ҳужайраларининг селекцияси 70
3.4. Pichia pastorisning MutS фенотипини олиш 75
3.5. HBsAg нинг озуқа муҳитдаги метанолнинг миқдорига ва Mut+
ва MutS фенотипларига боғлиқ ҳолдаги экспрессияси
78
3.6. рPIC3.5-S ва рPIC9-S рекомбинант плазмидалар сақловчи
Pichia pastoris штаммларининг экспрессия даражаларини
солиштириш
80
3.7. HBsAg оқсилининг Dot Blot ва иммуноблот таҳлиллари 83
ХУЛОСАЛАР 86
ФОЙДАЛАНИЛГАН АДАБИЁТЛАР 87
